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枯草芽孢杆菌发酵棉粕营养特性的研究

来源:必赢手机版博莱特生物饲料有限公司     日期:2018-05-23 01:12

随着畜牧业生产和饲料工业的发展,一些常规饲料,尤其是蛋白质饲料严重缺乏,越来越满足不了生产的需要。寻求非常规蛋白质饲料对我国畜牧业的发展起着非常重要的作用。而我国是产棉大国,棉籽产量居世界首位,而且棉籽经过加工榨油后的副产物棉籽饼粕是很好的蛋白质饲料。但是普通的棉籽饼粕具有抗营养因子和棉酚,使得棉籽饼粕不能大量使用。枯草芽孢杆菌生长速度快,营养需求简单,易于存活、定殖和繁殖,并且分泌多种酶和维生素,具有良好的发酵作用,因此利用微生物对棉粕进行生物发酵,消除抗营养因子,降低棉酚含量,提高棉粕的消化利用率具有重要意义。鲍振国等(2013)及和小黑等(2014)通过研究枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌和热带假丝酵母发酵棉粕,发现棉粕经过微生物发酵后均能不同程度地分泌各种酶类,降解粗纤维,提高粗蛋白含量,而且将蛋白降解为易于机体吸收的小肽,并能降解抗营养因子植酸等。因此试验拟通过枯草芽孢杆菌对棉粕进行发酵,探究其发酵前后棉酚、常规营养物质、小肽和氨基酸的含量的变化,为发酵棉粕的营养价值评定提供理论依据。


1  材料与方法



1.1 试验样品

发酵底料由90%的棉粕和10%的玉米组成,采用枯草芽孢杆菌菌种为Z3,由新疆石河子大学动物营养实验室选育。


1.2 营养琼脂培养基

蛋白胨10、牛肉膏3、NaCl 5和琼脂15g/L,pH 7.0,121℃条件下高压15min。


1.3 种子液培养

将枯草芽孢杆菌Z3挑取1环菌苔接入营养琼脂培养基,37℃培养24h后接入20mL(50mL三角瓶)营养肉汤培养基,37℃,200r/min摇动培养15h(一级菌种),取一级菌种1mL接入50mL(150mL三角瓶)营养肉汤培养基,37℃,200r/min摇动培养15h(二级菌种)。


1.4 试验方法

1.4.1 发酵底物处理

试验组底物处理:将棉粕90和玉米粉l0g加入500mL三角瓶中混合均匀,然后加入蒸馏水30mL,充分搅拌,在0.056MPa,121℃条件下蒸汽灭菌20min,冷却后于无菌条件下接入枯草芽抱杆菌Z3二级种子液7mL,搅拌均匀,三角瓶4层纱布封口,于恒温培养箱37℃静止培养72h。发酵结束后,将发酵产物放入烘箱中45℃烘干48h,冷却粉碎,过60目筛,装入样品袋,保存于4℃冰箱中待测。

对照组底物处理:将棉粕90和玉米粉10g加入500mL三角瓶中混合均匀,然后加入蒸馏水30mL,充分搅拌调湿,在0.056MPa,121℃条件下蒸汽灭菌20min,冷却后接入液体培养基(不含菌种)7mL,搅拌均匀,不经发酵,直接将其放入烘箱中,45℃烘干48h,冷却粉碎,过60目筛,装入样品袋,保存于4℃冰箱中待测。


1.4.2 棉酚含量的测定

总棉酚(TG)采用ISO6866—1985方法测定,游离棉酚(FG)采用GB13086—1991方法测定,结合棉酚(BG)按照BG=TG-FG计算得出。游离棉酚脱毒率/%=(发酵前底物FG单位含量-发酵后底物FG校正含量)÷发酵前底物FG单位含量×100。常规营养指标的测定采用国标法(GB6435)。


1.4.3 小肽含量的测定

分别称取样品1g溶于8mL蒸溜水,在25℃空气浴摇床振荡提取2h,混合液离心4000r/min20min,取上清液,过0.45μm微孔滤膜,4℃保存待测,采用高效液相色谱进行分析。色谱柱:型号TSKgelG2000SWXL,8mm×300min凝胶柱。流动相(体积比)∶水∶三氟乙酸为100%∶0.1%。检测波长:220nm。流速:1.0mL/min,柱温:30℃,进样体积:20μL。

以Gly-Leu(相对分子质量188u)、还原型谷耽甘肽(GSH,相对分子质量307u)、氧化型谷胱甘肽(GSSG,相对分子质量613u)和杆菌肽(相对分子质量1423u)作为相对分子质量标准建立保留时间与分子量的线性方程,经计算确定600、1000和1800u相对分子质量的保留时间。将样品在以上色谱条件下分析,选择这段时间内的峰,积分求得峰面积,相对分子质量大的先出峰,相对分子质量小的后出峰。


1.4.4 氨基酸含量的测定

样品粉末用甲醇水溶液(甲醇∶水=1∶1)充分提取,提取质量浓度为40mg/mL,提取液过0.45μm水系滤膜,滤液进行氨基酸前处理操作。

取10μL稀释液,置于试管内,加100μL日常工作液,涡旋混匀,高速离心。上清液转入另一试管,氮吹。加入60μL衍生工作液,涡旋混匀,旋转离心。65℃温育15min,然后离心氮吹。加入100μL乙腈水混合液复溶,涡旋混匀,旋转离心。使用液质联用质谱仪检测样本。

液相和质谱仪器型号:液相型号,HPLC Ultimate3000;质谱型号,3200 Q TRAPLC-MS/MS;色谱柱,AAA C 18,5μm,150mm×4.6mm,柱温50℃,进样量10μL;流动相A,水+0.1%甲酸;流动相B,乙腈+0.1%甲酸;CUR,20.00;CAD,Me-dium;CXP,5.00;IS,5500.00;DP,35.0;GS1,55.00;TEM,580.00;EP,10.0;GS2,60.00。


2 结果与分析




2.1 枯草芽孢杆菌发酵棉粕对棉酚含量的影响

从表2可见:底物灭菌对照组相对于底物不灭菌对照组总棉酚、游离棉酚和结合棉酚含量显著降低(P<0.05),分别降低2146.67、536.83和1609.84mg/kg。发酵组和底物灭菌对照组相比,其总棉酚、游离棉酚和结合棉酚含量显著降低(P<0.05),分别降低531.67、101.00和430.66mg/kg。棉粕底物经过灭菌后脱毒率为74.77%,而经过灭菌后再发酵,脱毒率进一步显著提高,脱毒率为88.84%,由以上分析可以得出,底物经过灭菌和灭菌后发酵可以使大部分游离棉酚降解消除,部分结合棉酚和总棉酚也被降解。


2.2 枯草芽孢杆菌发酵棉粕对常规营养成分的影响

从表3可见:底物不灭菌对照组、底物灭菌对照组和发酵组3组间的干物质差异不显著(P>0.05);底物灭菌对照组和底物不灭菌对照组相比,粗蛋白、粗脂肪、酸性洗涤纤维(ADF)、中性洗涤纤维(NDF)、钙、磷和粗灰分含量差异不显著(P>0.05);发酵组与底物不灭菌对照组和底物灭菌对照组相比,粗蛋白含量显著增加(P<0.05),蛋白含量分别增加14.37%和13.79%,粗脂肪、ADF和NDF含量显著降低(P<0.05),磷和钙含量显著增加(P<0.05)。底物经过灭菌后其常规营养成分含量基本不变,但是经过发酵后,其常规营养成分含量会有所变化,其中粗蛋白含量增加0.51%,其余常规营养成分含量下降。


2.3 枯草芽孢杆菌发酵棉粕对小肽含量的影响

从表4可见:底物不灭菌对照组和底物灭菌对照组小肽含量差异不显著(P>0.05);发酵组棉粕中的小肽含量均高于未发酵的棉粕,且差异显著(P<0.05),其中小于600、600~1000和1000~1800u的小肽含量分别提高到12.40%、1.45%和1.79%。底物高压对小肽含量的产生影响不大,而经过发酵后小肽含量会明显的增加。


2.3 枯草芽孢杆菌发酵棉粕对小肽含量的影响

从表4可见:底物不灭菌对照组和底物灭菌对照组小肽含量差异不显著(P>0.05);发酵组棉粕中的小肽含量均高于未发酵的棉粕,且差异显著(P<0.05),其中小于600、600~1000和1000~1800u的小肽含量分别提高到12.40%、1.45%和1.79%。底物高压对小肽含量的产生影响不大,而经过发酵后小肽含量会明显的增加。




3 结论


枯草芽孢杆菌发酵棉粕能很大程度的降低游离棉酚的含量,降低率达到88.84%。同时经过发酵后蛋白质含量显著提高5.2%,显著的降低粗脂肪和粗纤维的含量。增加底物中肽类物质的含量,相对分子质量小于600、600~1000和1000~1800u小肽含量分别提高12.4%、1.45%和1.793%,而且必需氨基酸苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸和赖氨酸分别提高8.45%、6.25%、24.1%、3.5%、12.3%和9.52%。